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大鼠四氫孕酮(Allopregnanolone)ELISA檢測試劑盒說明

更新時(shí)間:2024-03-18      瀏覽次數(shù):990

檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被四氫孕酮(Allopregnanolone)抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的四氫孕酮(Allopregnanolone)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標(biāo)儀(450nm)

2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

1. 試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶wan全溶解后再使用。

2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

3. 濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白;按照說明書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍,最終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。

4.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5. 所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標(biāo)板

12孔×8條

12孔×4條

標(biāo)準(zhǔn)品

0.3mL*6管

0.3mL*6管

樣本稀釋液

6mL

3mL

檢測抗體-HRP

10mL

5mL

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

按說明書進(jìn)行稀釋

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

終止液

6mL

3mL

封板膜

2張

2張

說明書

1份

1份

自封袋

1個(gè)

1個(gè)

注:標(biāo)準(zhǔn)品(S0-S5)濃度依次為:0、2、4、8、16、32 nmol/L

試劑的準(zhǔn)備

20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1. 手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。

2. 自動(dòng)洗板機(jī):每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

操作步驟

1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;

3. 樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。

4.  除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。

6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在Excel工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

試劑盒性能

1. 準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,大于等于0.9900。

2. 靈敏度:最di檢測濃度小于0.1 nmol/L。

3. 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。

6. 有效期:6個(gè)月

免責(zé)聲明

1. 試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn),否則所產(chǎn)生的一切后果,由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān),本公司概不負(fù)責(zé)。

2. 嚴(yán)格按照說明書操作,實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作,后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。





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